退火温度确定的计算公式是：4×（G＋C）＋2×（A＋T）－（5～8）。退火温度（AnnealingTemperatre）是指引物和模板结合时候的温度参数，当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。它是影响PCR特异性的较重要因素。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。